抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性测定方法

抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性测定方法

酶液制备:取0.2g(可视情况调整)样品(新鲜叶片或根系)洗净后置于预冷的研钵中,加入1.6ml 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液(pH7.8)在冰浴上研磨成匀浆,转入离心管中在4℃、12000g下离心20min,上清液即为酶液。

一、超氧化物歧化酶(SOD)活性测定(氮蓝四唑光化还原法)

1、试剂的配制

(1)0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS,pH7.8):

A母液:0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O(分子量358.14)71.7g; B母液:0.2mol/L磷酸二氢钠溶液:取NaH2PO4·2H2O(分子量156.01)31.2g。 分别用蒸馏水定容到1000ml。

0.05mol/L PBS(pH7.8)的配制:分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml,B母液(NaH2PO4) 21.25ml,用蒸馏水定容至1000ml。

参考文献:李合生主编:植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社,2000:267~268。

(2)130mM甲硫氨酸溶液:取1.9399g Met用磷酸缓冲液(pH7.8)定容至100ml。

(3)100μM EDTA-Na2溶液:取0.03721gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml。

(4)20μM核黄素溶液:取0.0753g核黄素用蒸馏水液定容至1000ml,避光保存。

(5)750uM 氮蓝四唑(NBT)溶液:取0.06133g NBT用PBS定容至100ml,避光保存。

2、酶活性测定

(1)取10ml试管(要求透明度好)

测试管:分别依次加入3.5ml缓冲液+0.5ml甲硫氨酸(Met)溶液+0.5ml氮蓝四唑(NBT)溶液+0.5ml EDTA-Na2溶液+0.4ml蒸馏水(混合后摇匀)+0.1ml酶液+0.5ml核黄素溶液;

对照管(2个):分别依次加入3.5ml缓冲液+0.5ml甲硫氨酸(Met)溶液+0.5ml氮蓝四唑(NBT)溶液+0.5ml EDTA-Na2溶液+0.5ml蒸馏水(混合后摇匀) +0.5ml核黄素溶液;其中1支试管照光后测定作为最大光还原管,另1支置于暗中测定时用于调零。

(2)将一支对照管置于暗处,其余试管置于光照培养箱中在4000 lux光照下反应20min;

(4)以不照光的对照管调零后,避光测OD560(出现颜色即可测定)。

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