第32卷中 南 林 业 科 技 大 学 学 报87

八角基因库、国有六万林场、国有高峰林场及广东华南植物园等地，共56份，所有样品均采摘新鲜嫩叶10片左右，用封口袋密封，放入冰盒中带回实验室，置于-20 ℃冰箱中低温保存。1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 本试验采用改良CTAB法提取.其具体步骤如下：① 将叶片置于盛有变色硅胶干燥器内干燥，称取材料50 mg,液氮研磨3～4次，将粉末放到装有800 μL 2×CTAB提取缓冲液[100 mmol/L Tris.cl(pH＝8.0)，20 mmol/L EDTA，1.4 mmol/L Nacl，2 % (W/V)CTAB,40 mmol/L巯基乙醇]的2 mL离心管中；② 加入60 μL巯基乙醇混匀，60 ℃预热30 min，其间混匀2～3次，取出样品于室温放置；③ 待样品冷却到室温加入800 μL氯仿∶异戊醇(24∶1)，振荡混匀，12 000 r·min-1离心15 min；④ 取上清液于一新的2 mL Ep管中加入1.5倍体积的 1×CTAB沉淀液[50 mmol/L Tris.Cl(pH＝8.0)，10 mmoL/L EDTA，1 % (W/V)CTAB, 20 mmol/L巯基乙醇]，放置20～30 min，12 000 r·min-1离心15 min；⑤ 将沉淀晾干，溶于200 μL TE-buffer中，再加入400 μL 95 %乙醇，20 μL 3 M NaAC, －20 ℃沉淀1 h，4 ℃ 12 000 r·min-1离心15 min；⑥ 再将沉淀用500 μL 75 %乙醇清洗，12 000 r·min-1离心10 min，加入30～50 μL TE-buffer 溶解DNA；⑦使用0.8 % 琼脂糖凝胶，在电泳缓冲液0.5×TBE中电泳检测DNA纯度、完整性和产量，电压180 V，电泳时间40 min.

1.2.2 限制性酶切及连接体系 限制性酶切及连接采用一步进行，即在0.5 mL离心管中加入对照模板DNA(浓度为50 ng/ μL)或DNA模板 n μL、Adapter 1μL、Pst I/Mse I mμL、10 XReaction buffer 2.5 μL、10 mmol ATP 2.5 μL、T4 Ligase 1 μL以及AFLP-Water，构成共计20 μL的反应体系.混匀后离心数秒，37 ℃保温5 h，8 ℃保温4 h，4 ℃过夜.限制性酶切及连接与样品DNA用量和酶用量有关，为了确定最佳样品用量和合适的酶用量，将样品DNA模板用量设为100、200、300 ng(样品浓度为50 ng/ μL，即加入2、4、6 μL样品DNA)；利用Pst I/Mse I 2种限制性内切酶进行双酶切，其用量设为1 、2 、3、4 μL共4个水平。当酶切—连接完成后，取酶切产物5 μL，加入load buffer 2 μL混

合后，在0.8 % 的琼脂糖凝胶中检测酶切效果。

1.2.3 预扩增体系 该反应体系总体积为25 μL，即在0.2 ml离心管中加入模板DNA 2μL、Pre-ampmix 1±0.5μL、dNTPs 0.5μL、10XPCR buffer 2.5μL、Taq DNA polym ease 0.5μL、AFLP-Wat er 18.5±0.5μL.在预扩增时，选用的预扩增引物序列为Pst I预扩增引物序列5’＞GAC TGC GTA CAT GCA G＜3’、Mse I预扩增引物序列5’＞GAT GAG TCC TGA GTA A C＜3’，用量设为0.5、1.0、1.5 μL共3个梯度，以确定合适的引物用量.离心数秒后，按下列参数：变性94℃ 2 min (变性94 ℃ 30 s，复性56 ℃ 30 s，延伸72℃ 80 s )延伸 72℃ 5 min进行PCR扩增，循环30轮.预扩增完成后，取5 μL预扩增产物在0.8 % 的琼脂糖凝胶中检测预扩增效果。

1.2.4 选择性扩增体系 反应体系总体积为25 μL，即在0.2 mL离心管中加入预扩增稀释样品 2μL、10XPCR buffer 2.5μL、dNTPs 0.5μL、Pst I引物1μL (共8种)、Mse I引物1μL (共8种)、Taq酶 0.5μL、AFLP-Water 17.5 μL，混匀后，离心数秒，按下列参数PCR循环：(1)第一轮扩增参数为94 ℃ 30 s，65℃ 30 s，72 ℃ 80 s；(2)以后每轮循环温度递减0.7℃，扩增12轮；(3)接着按下列参数扩增23轮94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 80 s。产物稀释的倍数对选择性扩增效果影响很大，本研究将预扩增产物的稀释倍数设为10、20、30倍以确定适宜的稀释倍数。引物选用北京鼎国生物技术有限责任公司合成的Pst I/Mse I引物，共64种组合，经试验筛选出效果较好的几对引物组合进行选择性扩增。

2 结果与分析

通过CTAB法提取纯度高的八角基因组DNA，见图1。并按照预先的设计方案，对AFLP体系的条件进行筛选，获得了优化的AFLP反应体系，具体优化方案见表1。

通过该优化体系，成功的分析了八角种质资源的遗传多样性。从64对引物中筛选出6对扩增产物丰富的引物进行扩增，引物组合分别为：P-GAG/M-CAA、P-GAG/M-CAG、P-GTC/M-CTA、P-GTC/M-CTG、P-GTG/M-CAA、P-GTG/M-CAC.所筛选的6对引物共扩增得到989条带，其中多态性条带为988条，多态性比率高达99.90 %.经过体系的优化，得到了条带清晰的AFLP图谱，见图2。