通过PCR方法将已克隆的内切葡聚糖酶基因(GenBank No. DQ782954)信号肽编码序列去除, 然后与表达载体pHIS1525连接后转化大肠杆菌DH5a, 筛选出阳性转化子DH5 a -pHIS1525-G7并提取质粒进一步转化巨大芽孢杆菌WH320原生质体, 获得基因工程菌WH320-pHIS1525-G7。刚果红染色和SDS-P

650 HEREDITAS (Beijing) 2008 第30卷

是纤维素降解酶系中的重要一员, 纤维素的降解首先由葡聚糖内切酶随机切割β-1, 4主键, 进而由纤维二糖酶和β-葡萄糖苷酶完成彻底降解[1]。目前, 纤维素酶基因的克隆与表达的研究已经成为纤维素酶分子生物学研究的热点。

随着纤维素酶分子生物学的研究不断深入, 越来越多的纤维素酶基因被克隆与表达。来源于纤维素降解微生物的纤维素酶基因的异源表达, 使用最多的宿主就是大肠杆菌。然而, 在安全性、生产技术及蛋白分泌等方面, 巨大芽孢杆菌比大肠杆菌更具作为表达宿主的优势。

目前还未见有关在巨大芽孢杆菌中表达内切葡聚糖酶的报道, 本实验将已克隆的内切葡聚糖酶基因(GenBank No. DQ782954)[2]转入巨大芽孢杆菌WH320中, 实现了该基因在芽孢杆菌中的高效表达, 并对表达产物进行了酶学性质的研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌种与质粒

Escherichia coli JM109与E. coli DH5α为本实验室保存, Bacillus megaterium WH320与质粒pHIS1525购于MoBiTec公司, 质粒pMD18-T Vector购于TaKaRa(大连)公司, B3质粒(含已克隆的内切葡聚糖酶基因)为本实验室构建及保存。 1.1.2 酶和试剂

Taq DNA聚合酶、限制性内切酶、T4 DNA连接酶购于TaKaRa公司; 质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒、DNA MarkerⅢ、DNA Marker Ⅶ、λDNA/HindⅢ、蛋白质MarkerⅡ购自天根生化科技有限公司; 氨苄青霉素、四环素、溶菌酶购自上海生工生物工程技术服务有限公司。 1.1.3 培养基

LB培养基见参考文献[3]; AB3培养基配成1.75%, 购自Difco公司; 芽孢杆菌转化培养基、SMMP液、SMM液、和CR5培养基的配置参考MoBiTec公司Bacillus megaterium Protein Expres-sion System操作手册; 发酵培养基使用LB培养基, 四环素工作浓度为10 μg/mL。 1.2 方法

1.2.1 引物设计

根据内切葡聚糖酶基因序列及表达载体pHIS1525酶切位点序列, 结合信号肽预测结果, 应

用Primer premier5.0软件设计出如下PCR引物, 在上游引物5′端引入一个BglⅡ位点和碱基CA, 在下游引物5′端引入一个SphⅠ位点, 并可通过PCR去掉内切葡聚糖酶基因自身信号肽编码序列:

上游引物(P1):

5′

SphⅠ CA是为了不改变阅读框而引入的碱基 下游引物(P2):

5TTTGGTTCTGTTCCCCAA3′

BglⅡ

1.2.2 质粒提取

质粒提取和胶回收均按试剂盒操作说明进行。 1.2.3 目的基因的获得

以提取的B3质粒为模板, 根据设计的引物进行PCR, 反应参数为：94℃预变性2 min, 94℃变性 1 min, 65℃复性1 min, 72℃延伸90 s, 30个循环后, 72℃再延伸10 min。 1.2.4 连接与转化

将胶回收的PCR产物与pMD18-T Vector连 接后转化大肠杆菌JM109, 在含有氨苄青霉素 (10 μg/mL)的LB平板上通过菌落PCR筛选阳性转化子。

1.2.5 重组表达质粒的构建

提取阳性转化子质粒, 经BglⅡ、SphⅠ双酶切后胶回收目的条带。然后与同样双酶切处理并回收的表达质粒pHIS1525进行连接, 转化大肠杆菌DH5α。在含有氨苄青霉素的LB平板上长出菌落后, 通过菌落PCR筛选阳性转化子。

1.2.6 重组质粒转化巨大芽孢杆菌WH320

芽孢杆菌WH320原生质体的制备参见文献[4], 略有改动: OD600=1.0; 加溶菌酶终浓度为0.1 mg/mL, 菌液置37℃水浴保温约30 min。将构建好的重组表达质粒按MoBiTec公司的操作手册进行芽孢杆菌转化, 同时以质粒pHIS1525转化芽孢杆菌作为阳性对照。 1.2.7 内切葡聚糖酶基因的诱导表达

将重组芽孢杆菌接入含四环素的LB培养基中37℃培养12 h, 以5%的接种量接种到含相应抗生素的LB培养基中继续培养4 h后取样作为诱导前样品, 加入终浓度为0.2%的木糖, 分别在诱导2.5 h、6 h和9 h后取样, 4℃条件下4 000 r/min离心10 min收集上清液。

1.2.8 表达产物的分析和鉴定

通过刚果红染色和对上清液进行SDS-PAGE分析, 检测重组蛋白的表达情况。刚果红染色参见文