目的：探讨通过RNA干扰技术抑制MTA1的表达及对乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖和细胞周期的影响。方法：建立3种稳定表达靶向MTA1的shRNA的MDA-MB-231细胞系。通过反转录-聚合酶链反应(reverse transeription-polymerase chain reaction,RT-PCR)和免疫组化法验证基因表达的抑制效果;采用细胞计数法及噻唑蓝(thiazolylblue,MTT)法检测细胞的增殖能力;流式细胞仪分析细胞周期。结果：

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肿瘤 2 0 0 7年 l 2月第 2 7卷第 l 2期

T u m o r V o 1 . 2 7, N o . 1 2。D e c e m b e r, 2 0 0 7

9 5 7

B a s i c R e s e a r c h 基础碍究

R N A干扰抑制 MT A 1的表达对乳腺癌细胞 MD A - MB - 2 3 1增殖的影响 张萍，张徽，姜青明 4 0 0 0 1 6 ) (重庆医科大学病理教研室，重庆

[摘要] 目的：探讨通过 R N A干扰技术抑制 MT A 1的表达及对乳腺癌细胞 MD A— MB一 2 3 1增殖和细胞周期的影响。方法： 建立 3种稳定表达靶向 MT A 1的 s h R N A的 MD A . M B . 2 3 1细胞系。通过反转录一聚合酶链反应( r e v e r s e t r a n s c r i p t i o n— p o l y m e r a s e

c h a i n r e a c t i o n, R T— P C R)和免疫组化法验证基因表达的抑制效果；采用细胞计数法及噻唑蓝( t h i a z o l y l b l u e, M 1 T r )法检测细胞的增殖能力；流式细胞仪分析细胞周期。结果： MT A 1基因被抑制后，其m R N A表达明显下降， R T . P C R结果显示，稳定转染 3种 重组质粒后， MT A1 mR N A水平较对照组分别下调了 7 O . 0 7%、 8 2 . 4 0%和6 3 . 4 4%;同时， MD A . MB一 2 3 1细胞的生长明显受抑

制，与对照组细胞相比，细胞计数示细胞数目明显减低； M r r r分析示细胞增殖下降，流式细胞分析示细胞周期阻滞在 G o/ G 期。结论：在 MD A M B一 2 3 1细胞中，抑制 MT A1的表达可有效抑制细胞生长并导致细胞周期的阻滞；利用 R N A干扰技术抑制 肘 1的表达可能会成为一种有效的乳腺癌基因治疗手段。

[关键词] 乳腺肿瘤； R N A,小分子干扰；肿瘤转移相关基因；MD A— MB - 2 3 1细胞

[中图分类号] R 7 3 7 . 9

[文献标识码] A

[文献编号] 1 0 0 0— 7 4 3 1 ( 2 0 0 7 ) 1 2 - O 9 5 7 - 0 5

Ef fe c t s o f s u pp r r￣s i o n o f M TA 1 e x p r e s s i o n b y RNA i n t e r f e

r e n c e o n pr o l i f e r a t i o n o f h u ma n br e a s t c a r c i no ma c e l l l i ne M DA. M B- 2 31

Z HA N G P i n g,Z H A N G Hu i, J I A N G Q i n g— m i n g ( D e p a r t m e n t o f P a t h o l o g y, C h o n g q i n g Me d i c a l U n i v e r s i t y, C h o n g q i n g 4 0 0 0 1 6, C h i n a )

[ A B S T RA C T] Ob j e c t i v e: T o e x p l o r e t h e e f f e c t s o f s u p p r e s s i n g MT A 1 e x p r e s s i o n u s i n g R N A i n t e f r e en r c e t e c h n i q u e o n t h e p r o l i f e r a t i o n a nd c e l l c y c l e o f hu ma n br e a s t c a r c i no ma c e l l l i n e M DA M B- 23 1 .M e t ho ds:W e e s t a bl i s h e d t hr e e M DA M B- 2 3 1 c e l l l i ne s wh i ch ha d s t a b l e e x pr es s i o n o f M TA1 t a r g e t e d s h RNA. Th e s up p r e s s i o n o f MTA 1 e x p r e s s i o n wa s v e if r ie d by RT PCR a n d i mmun o hi s t oc h emi s t r y . Ce l l p r o l i f e r a t i o n c a p a c i t y wa s e v a l ua t e d b y c e l l c o u n t i ng a nd M1 T r a s s a y. Th e c e l l c y c l e wa s a n a l y z e d b y lo f w c yt o me t y . Re r s ul t s: Ex p r e s s i o n o f MTA 1 m RNA wa s s i g ni ic f a n t l y d o wn r e g u l a t e d a f t e r s i l e n c i n g肘 1 g e ne

b y RNA i nt e fe r e nc r e. RT P CR r e s u l t s s h o wed

t h a t t h e e x p r e s s i o n o f MT A1 mRNA wa s d o w n r e ul g a t e d b y 7 0 . 0 7% . 8 2. 4 0% . 6 3 . 4 4% i n MDA MB - 2 31 c e l l s ft a e r s t a b l e t r a n s f e c t i o n o f t hr e e t y pe s o f p l as mi ds . h e T g r o wt h o f M DA M B- 23 1 c e l l s wa s i n hi b i t e d s i g n i ic f a nt l y. Co mp re a d wi t h t h e c o nt r o l ro g u p,t he c e l l R um b e r s i g n i ic f a n t l y d e c r e as e d .M1 T r a s s a y a n d lo f w c y t o me t y r s h o we d t h a t c e l l p r o l i f e r a t i o n c a pa c i t y d e c r e a s e d a n d t h e c e l l s we e r a r r e s t e d a t

G 0/ Gl p h a s e ft a e r s i l e n c i n g肘

1 g e n e .Co n c l u s i o n: S u p p r e s s i o n o f t h e e x p r e s s i o n o f MT A1 i n MDA MB- 2 3 1 c e l l s e f f e c t i v e l y i n h i b i 1 g e n e b y R NA i n t e f r e r e n c e ma y b e a u s e f u l a p p oa r c h o f g e n e t h e r a p y

t e d c e l l p r o l i f e r a t i o n a n d i n d u c e d c e l l c y c l e a re s t .S i l e n c i n g肘 f o r hu ma n b r e a s t c a r c i no ma .

[ KE Y WOR D S] B r e a s t n e o p l a s ms; R N A, s m a l l i n t e f r e i r n g;M e

t a s t a s i s a s s o c i a t e d g e n e; MD A MB - 2 3 1 c e l l s [ T u m o r, 2 0 0 7, 2 7 ( 1 2 ): 9 5 7 - 9 6 1]

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，该肿瘤具有高转移性，其预后与癌细胞的侵袭和早期转移 密切相关。肿瘤转移相关基因 ( me t a s t a s i s a s s o c i a t e d

2 3 1中的 MT A 1基因进行 R N A干扰 ( R N A i n t e r f e r -

e n c e, R N A i )研究，发现针对靶序列的 s h R N A可有效 抑制 MT A 1的表达。 1材料与方法

g e n e 1, M T A 1 )是T 0 h等¨刮从鼠/人乳腺癌转移系统 中筛选克隆出来的。实验证实， MT A 1表达与许多 肿瘤的浸润转移密切相关，为乳腺癌的基因治疗提

1 . 1 细胞株、菌株和质粒

人乳腺癌细胞株 MD A—

供了又一个潜在的靶点。本研究通过短发夹状 R N A( s h o r t h a i r p i n R N A, s h R N A)载体 p G e n e s i l - 1携带靶向 MT A 1的 s h R N A,对乳腺癌细胞 MD A - MB - [作者简介]张萍( 1 9 8 O一),女(汉族 ),硕士研究生 徽)

MB - 2 3 1,为本室保存。细胞株按常规方法进行培 养，培养液为含 1 0%胎牛血清 ( F B S )的R P M I 1 6 4 0

培养液，取对数生长期细胞进行实验。D H 5 a大肠杆菌和真核表达载体 p G e n e s i l . 1为本室保存。载体 p G e n e s i l . 1含抗 G 4 1 8的耐药基因，可在 G 4 1 8作用 下筛选稳定转染的细胞，同时携带绿色荧光蛋白

C o r r e s p o n d e n c e t o: Z H AN G H u i (张 T e l: 0 2 368 4 8 5 7 8 9

E ma i l: z h a n g h u i 2 0 01 5 7@s i n a . c o m

( G F P )基因，可直接在荧光显微镜下观察转染效率。