334 第二军医大学学报　2003年3月,第24卷

1.3　FITC标记蛋白　按文献[5]方法对AnnexinB1进行FITC标记。

1.4　细胞凋亡的诱导及检测　将Jurkat细胞培养

2　结　果

至对数生长期,调整细胞数为1×106/ml,除未诱导

的阴性对照外,余均加羟基喜树碱至终质量浓度为20μg/ml。未诱导组及诱导组均置CO2孵育箱37℃培养,6h后收集细胞,PBS洗涤细胞2次,结

纯化后蛋白行SDS2PAGE分析,有3.2万的单

一蛋白条带,纯度达98%以上。经Western印迹分析证实具有AnnexinB1的免疫原性。

羟基喜树碱处理的Jurkat细胞经AnnexinB12FITC及PI标记后,荧光显微镜下可见凋亡细胞呈明亮的黄绿色荧光,PI染成红色,。此结果与Ⅴ2(1)。

合缓冲液200μl重悬细胞,然后加入20μg/ml的

AnnexinB12FITC5μ2l(或20μg/ml的AnnexinⅤFITC),再加入50μg/ml的PI10μl,室温避光轻轻混匀反应体系1015min,置荧光显微镜下观察。

图1　FITC标记的AnnexinB1及AnnexinⅤ分别对羟基喜树碱诱导(A、C)和未诱导(B、D)Jurkat细胞凋亡的检测

Fig1　FITClabelledAnnexinB1andAnnexinⅤindetectionofJurkatcellapoptosisinducedwithhydroxycamptothecine(A,C)andwithoutinduction(B,D)

redistributionofplasmamembranephosphatidylserineisageneralfeatureofapoptosisregardlessoftheinitiatingstimulus:inhibitionbyoverexpressionofBcl22andAbl[J].JExpMed,1995,182(5):154521556.

[3]　孙树汉,王俊霞,陈蕊雯,等.囊虫病诊断用抗原编码cDNA的

3　讨　论

AnnexinB1为本室首次克隆的新的Annexins

亚家族,以往研究表明其可在钙离子存在情况下与活化血小板膜表面的磷脂结合,因而具有显著的抗凝抗栓功能[6,7]。根据它的膜磷脂结合活性,我们尝试把它应用于细胞凋亡的检测。实验表明,AnnexinB1结合荧光染料能有效快速地检测早期

分子克隆[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志,1997,15(1):152

20.

SunSH,WangJX,ChenRW,etal.MolecularcloningofcDNAencodingimmunodiagnosticantigensofcysticercosis[J].Zhongguo

JishengchongxueyuJishengchongbingZazhi(ChinJParasitolparasiticDis),1997,15(1):15220.

凋亡细胞,且在应用基因工程方法制备AnnexinB1蛋白时,发现其在大肠杆菌表达体系中多为可溶性蛋白形式,为后续制备带来了便利。AnnexinB1生产工艺简单,在应用于细胞凋亡检测时与国外类似产品相比同样具有处理细胞量多,敏感性高,快捷等优点。我们将继续深入进行AnnexinB1用于细胞凋亡检测的研究,开发价廉高效并拥有我国独立知识产权的凋亡试剂。[参考文献]

[1]　VermesI,HaanenC,Steffens2NakkenH,etal.Anovelassayfor

apoptosis.Flow

cytometric

detectionof

phosphatidylserine

expressiononearlyapoptoticcellsusingfluoresceinlabelledAnnexinⅤ[J].JImmunolMethods,1995,184(1):39251.[2]　MartinSJ,ReutelingspergerCP,McGahonAJ,etal.Early

[4]　YanHL,SunSH,ChenRW,etal.Cloningandfunctional

identificationofanovelannexinsubfamilyinCysticercuscellulosae[J].MolBiochemParasitol,2002,119(1):125.

[5]　沈关心,周汝麟主编.现代免疫学技术[M].武汉:湖北科学技

术出版社,2002.127.

[6]　张　毅,杨湘越,陈蕊雯,等.大肠杆菌与毕赤酵母表达系统制

备的Annexin32的抗凝血活性分析[J].第二军医大学学报,

2002,23(8):8252827.

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JunyiDaxueXuebao(AcadJSecMilMedUniv),2002,23(8):

8252827.

[7]　ZhangY,ChenRW,SunSH,etal.TheinfluenceofAnnexin32,a

newCa2+2dependentphospholipid2bindingprotein,oncoagulationtimeandthrombosis[J].SciinChina(SeriesC),2002,32(2):1722176.

[收稿日期]　2003201206　　[本文编辑]　孙　岩

[修回日期]　2003202225