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动物固体组织蛋白提取 Protocol

1、 前夜将磁珠及匀浆管洗净置入75%乙醇中浸泡。早晨取出磁珠和匀浆管，自然晾干；也

可放入烤箱中，速度较快。

2、 裂解液配制：RIPA：PMSF=100：1，现配现用。（1000ulRIPA+10ulPMSF）。置入4℃冰

上。

3、抽蛋白（应冰上进行）：

a、适量组织（最好放入液氮中反复研磨成粉状）加入裂解液中。一般10ml管体系中加入：7-8粒磁珠、100mg组织、1mlRIPA+10ulPMSF、1 tablet Cocktail。 b、匀浆。

手工匀浆：将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中，再将剩余的1/3匀浆介质或生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆管中进行匀浆，左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研磨数十次（6～8分钟），充分研碎，使组织匀浆化。

机器匀浆：用组织捣碎机10000～15000r/min上下研磨制成10％组织匀浆，也可用内切式组织匀浆机制备（匀浆时间10秒/次，间隙30秒，连续3～5次，在冰水中进行），皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。

超声粉碎：用超声粉碎机进行粉碎，可用Soniprep150型超声波发生器以振幅14微米超声处理30秒使细胞破碎，也可用国产超声波发生仪，用40安培，5秒/次，间隙10秒反复3～5次。

反复冻融：培养或者分离的细胞可以用以上的方法匀浆，也可以反复冻溶3次左右（即让细胞加适量的低渗液或者双蒸水放低温冰箱中结冰，溶解，再结冰，再溶解，反复3次左右），但有部分酶活力会受影响。 c、将组织匀浆转入1.5ml的EP管中（eppendorf 管、离心管）。12000r/min 4°C 离心15min。 d、离心后EP管中液体分三层，提取中间无色液相，移入新的EP管中。可-80℃保存。 4、蛋白浓度测定。

a、配工作液：溶液A：溶液B=50：1（200ul：4ul）。

需测试复孔。标本X，则需A量=2*（X+1+1

）*200；B=2*（X+1+1）*4。

c、复孔，取蛋白6ul加入0.6mlEP管，再加入54ulH2O，混匀。即10倍稀释。

d、取20-25ul 10倍稀释蛋白样本加入96孔板平底板内，再加入200ulAB工作液，混匀振荡后，37℃ incubate 30min。

注：应现加蛋白样本，再加工作液。因为每次加蛋白后需换tip，再加入工作液即起反应，应缩短时间。

e、酶标仪检测562nm吸光度。Program f、计算蛋白浓度。

根据标准曲线，如 Y=1.2745X-0.1684 其中Y：蛋白浓度；X：吸光度。 最终蛋白浓度为：10*Y（ug/ul、mg/ml） g、蛋白样本放-80℃冻存。

大多数蛋白样品可通过比色测定法定量。在典型的蛋白测定中，化学试剂加入到蛋白样品溶液里产生颜色变化，这一变化可由分光光度计或酶标仪检测，并与已知浓度的蛋白标