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第四军医大学学报 u t h Fo t J d i Ml i U n M

第 1 1卷第 3期 1 9 90年 5月 V o i1 11 N .

o

.

3

盯

19M 0 9

胶原蛋白的氨基酸测定方法 刘智广 摘 、

陈摈复 (中心实验室 ) 怨脯氨酸和经赖氨酸是胶原蛋白特有的氨基酸 . .

要

,

测定组织和体液中的氨基酸含量可为胶原性疾病的研 ,

究诊断和防治提供依据

1我们在欣油m助 1 2 M B氨基酸分析仪建立的胶原蛋白氨基酸测定方法

,

对胶原蛋白进

行酸水解后采用自编的双柱胶原蛋白分析程序测定

本方法简单快速

、

,

样品需要量少 (数 1 0

略 )灵敏度高 .

,

(l

的诵 0 1/L )

,

重复性好 (卯铭% )在 6 5

.

,

~

内可得到包括经脯氨酸和经赖氨酸等 1 9

种氨基酸含量

关扭词

胶原蛋白;酸水解;经脯氨酸;经赖氨酸 a

D e te m n r i L IU 一

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胶原蛋白是机体结缔组织的主要成分 , ,

1 2混合氛基酸标 、

准液的配制 、

取校正氨基 .

其氨基酸组成与其它蛋白质比较含有较多’的经脯氨酸和经赖氨酸而缺乏色氨酸〔〕 。

酸标准液经脯氨酸标准液经赖氨酸标准液 各 4 0月于 o m l容量瓶加 p H 2 2 r 0 至 1 m l每种氨基酸的浓度为 l o 0 1 3 B e ck r坦n .

,

缓冲液 pm

人体某些胶原性疾病可引起组织和体液中氨

。

o/L l

。

基酸含量的改变 ,

〔“二,

测定组织和体液中氨 、

1 2 1M B型

氛基酸分析仪工作 B e km n a c ,

、

基酸的含量可为胶原性疾病的临床研究诊

条件 AA 一 10 c

分析程序:

自编双柱胶原蛋白水解 填充树脂: 长柱床 20 c m .

断和防治提供依据 的方法是电泳法样品需要量大 ,

。

传统测定胶原蛋白含量 习 ,

液氨基酸分析程序; 型;柱床高度: .

〔’

一

其操作步骤复杂 ,

,

短柱 ,

且精确度差;氨基酸分析仪 只 ,

床 s

m;柱温变化范围: 4 0一 5℃;洗脱缓冲 p H 3巧和 p H 3 90 ,

通常采用蛋白酸水解液氨基酸分析程序

液:长柱为

短柱为 p H .5 2 6; ,

能分析出 1 7

种氨基酸

测不出胶原蛋白特

上样量为 5 0川;缓冲液流速为 1 m l/ h荀三 0酮流速为 s m l h;检测波长/ n ,

有的经脯氨酸和轻赖氨酸; ] i[品的分析时间为

220 m n 2 ,

用生理体液分析 ,

:

经脯氨酸和脯 。

程序对胶原蛋白酸水解液进行分析 。

每份样

不利于推广应 1 2 1M B

用

为此 ,

,

我们在B

ee

km

a n

氨基酸 ,

氨酸为 4 4 0 m其它氨基酸为 5 70 n m L4胶原蛋白的水解方法准确称取 0 5一 1 0 m g蛋白样品于消化管中加 2 m l 0 . .

{

{ ’

,

分析仪等 1 .

建立了胶原蛋白的氨基酸测定方法 。

6 m

o

l/ L H C I (如果为液体样品则加 ,

等量

12

i在 6 5 m n内可得到包括经脯氨酸和经赖氨酸 19种氨基酸含量

m h ,

o

l/L H C I )

抽空下封

口 ,

,

1 10℃

水解 24 重复三

水解液冷却后移至塔祸 70℃

水浴挥发 , ,

材料和方法 P H 2 20 .

H ,

O ,

,

再加人少量双蒸馏水 微孔滤膜抽滤 ,

,

蒸千 。

1 1试剂

P H 3 15

.

,

.

PH 3 90

和 ,

次 . .

用适量 p H 2 .2 0缓冲液溶解 pm

定容

,

p H .5 2 6柠檬酸钠

缓冲液 (均为自配试剂 ) ,

0 4

滤液备用

6 m o/L HC I f

(分析纯 ) o

氨基酸校正标准液 ,

1 5兔软骨组织水解液的制备

0分别取 1只 ,

(B c

c

km

an

,

7内含 1 l/ L

种氨基酸

每种氨基酸 o

兔 (新西兰种 )的膝关节软骨组织 ,

10

℃烘 。

烤 2 4 h磨碎按胶原蛋白的水解方法处理 2结果和讨论

浓度为

.

2 5 mm

)

,

.

2 5 mm ,

l/L经脯

氨酸标准液 (上海生化试齐厂用 d冲液配制 ) ,

p H .2

加缓

.2 5 m m o f .

/L经赖氨酸标准液 。

混合标准液和软骨组织蛋白水解液的氨

( S ig m,a用 P H 2 2 0缓冲液配制 )

基酸分析结果见图

1和图 2

,

由色谱图可知: